При работе с препаративными колонками, в частности с колонками значительной высоты, в тех случаях, когда желательно увеличить скорость тока раствора, лучше применять избыточное давление. Применение вакуума в последнем случае часто приводит к уменьшению количества растворителя в нижней части колонки и последующему нарушению разделения в этой зоне.

Равномерность заполнения колонки можно проверить, пропуская через нее раствор красителя, например метилрота, в растворителе, который будет применяться. Для этого растворителю дают стечь с верха колонки, после чего добавляют из медицинской капельницы приготовленный раствор красителя, равномерно распределяя его по поверхности целлюлозы, а затем вымывают растворителем, возвращая на место резервуар с растворителем, как только окрашенная зона начнет двигаться вниз вдоль колонки. Если  краситель движется вдоль колонки как  горизон­тальная окрашенная зона, колонка заполнена равномерно и годна к употреблению. Если окрашенная зона движется неровно, колонка заполнена неправильно и ее нужно заполнить снова.

Наиболее удобные растворители для колонки определяются посредством хроматографии на бумаге. Большинство растворителей, применяемых в хроматографии на бумаге, можно использовать для колонки при хроматографировании на целлюлозе. Однако муравьиная кислота, если ее применять в течение длительного времени для колонки с целлюлозой, вызывает деструкцию целлюлозы и колонка становится неприемлемой для дальнейшей работы. Кроме того, муравьиную кислоту трудно удалить из элюата, поэтому применения ее следует избегать.

Если используемый растворитель содержит кислоту (например, уксусную) или основание (например, пиридин), их следует удалить из илюата, прежде чем начать упаривание последнего, чтобы избежать изменений выделяемых сахаров или их производных. С этой целью элюат обычно встряхивают в делительной воронке с равным объемом воды, а затем водный слой экстрагируют эфиром в течение нескольких часов в экстракторе. Эта методика не применима к таким производ­ным сахаров, как, например, метиловые эфиры, и в этих случаях для удаления кислот и оснований нужны особые методы.

Все органические растворители, которые применяются для колонок при хроматографировании на целлюлозе, перед употреблением следует перегнать, чтобы избежать появления масел и смол при последующем концентрировании фракций.

Колонку следует помещать в комнате с постоянной температурой — обычно 20—25°, хотя иногда необходима и более высокая температура, так как при этом возрастает скорость потока и можно использовать более высокие концентрации реагентов. Необходимо избегать колебаний температуры, так как понижение температуры может привести к выделении воды из раствора и нарушить разделение. Это обстоятельство особенно существенно при применении в качестве растворителя н-бутанола, насыщенного водой.

Образец, свободный от неорганических солеобразных веществ растворяют в минимальном количестве воды (фиксируя ее объем). К раствору добавляют сухой порошок целлюлозы в таком количестве, чтобы порошок был увлажнен, и к полученной смеси прибавляют дополнительное количество органических компонентов элюента. Полученную суспензию помещают в колонку поверх слоя целлюлозы. После того как образец немного осядет, поверх него осторожно помещают слой сухого порошка целлюлозы толщиной 2,5 см,  накрывают кружком из пористой фильтровальной бумаги и начинают пропускать растворитель для колонки.

Отбор фракций производится с помощью различных автоматически коллекторов; они работают по принципу измерения веса, объема фракций или времени элюирования. 

Компоненты можно определить с помощью различных общих цветных реакций. Гарделл применял построение концентрационных кривых элюата и сравнивал их с аналогичными кривыми, полученными для стандартных растворов сахара в том же самом растворителе.

Наиболее простой качественной пробой, по-видимому, является капельная проба: на фильтровальную бумагу помещают каплю элюата и обрабатывают бумагу щелочным раствором нитрата серебра.

Во многих случаях желательно помещать капли вытекающего элюата на хроматографическую бумагу и проявлять ее обычным способом.

3. Тонкослойная хроматография /6/

3.1. КАЧЕСТВЕННАЯ ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ САХАРОВ

Качественный анализ смесей методом ТСХ позволяет определить

а) число компонентов в анализируемом образце

б) подвижность каждого компонента относительно фронта растворителя.

При качественной тонкослойной хроматографии необходимо учитывать следующие положения:

- При повышении температуры разделение, как правило, ухудшается. Влияние температуры не настолько велико, как в бумажной хроматографии, но, если проявляющая смесь содержит легколетучие растворители, состав ее  может измениться.

- Оптимальная толщина слоя сорбента равна примерно 0,25 мм.

- Небольшое содержание воды в сорбенте играет большую роль только при разделении производных углеводов в неполярных растворителях.

Тонкослойная хроматография (ТСХ) в том виде, в каком она известна сейчас впервые была описана Шталем 1958 г., а в 1961 г. появилось первое сообщение о применении ТСХ для разделения углеводов. Начиная с этого времени ТСХ широко используется для идентификации углеводов, в том числе незамещенных моно- и олигосахаридов и различных производных сахаров и сложных эфиров, циклических ацеталей и других производных. Тонкослойная хроматография имеет ряд преимуществ перед бумажной хроматографией:

1. Анализ занимает настолько мало времени, что результат становится известным уже через несколько минут, это делает ТСХ удобным методом при слежении за ходом реакции.

2. ТСХ можно использовать для разделения как свободных сахаров, так и их производных. 3.Метод характеризуется высокой разрешающей  способностью, например позволяет разделить  производный аномеров с молекулярным весом вплоть до 1500.

4. Для обнаружения пятен можно использовать различные реагенты, так как применяемые неорганические сорбенты намного прочнее бумаги.

5. Для анализа можно брать большие количества веществ, что облегчает обнаружение минорных компонентов смеси.

МЕТОДИКА (общие принципы)

Чаще всего для разделения углеводов используют силикагель G, силикагель Н, окись алюминия, кизельгур G и целлюлозу. Слабокислый силикагель обычно применяется при изучении производных сахаров. Если на силикагеле не удается достичь хорошего разрешения основных или нейтральных сахаров и их производных, используют окись алюминия — более активный, чем силикагель, сорбент, обладающий основными свойствами. Кизельгур и целлюлозу, являющихся нейтральными носителями, целесообразно применять, для анализа свободных сахаров.

Размер используемых пластинок зависит от цели анализа. Если ТСХ используется для контроля за ходом химической реакции, удобны предметные стекла микроскопа. Однако для качественного анализа лучше всего пользоваться пластинками размер ром 20X20X0,3 см. Перед нанесением слоя пластинки тщательно моют со стиральным порошком, споласкивают дистиллированной водой; и протирают насухо тканью, не оставляющей ворсинок. Если пластинки покрыты жиром, необходимо предварительно обработать их хромпиком или каким-нибудь горячим моющим средством.

Известно несколько способов нанесения слоя: намазывание, поливка, погружение и опрыскивание. Наиболее употребимых методы:

Опрыскивание. На три подставки (25x30 см) помещают 120 предметных стекол. Суспензию 20 г силикагеля G в 50 мл дистиллированной воды тщательно встряхивают в течение 1 мин, выливают в круглодонную колбу емкостью 250 мл и при помощи пульверизатора при медленном токе воздуха наносят слой на пластинки. Пластинки с нанесенным слоем сушат 10 мин на воздухе, затем досушивают и активируют, выдерживая 30 мин при 130 °С. Готовые к употреблению пластинки хранят на подставке в эксикаторе.

Намазывание. Суспензию 30 г силикагеля Н в 80 мл дистиллированной воды наносят на пять (20x20X0,3 см) чистых стеклянных пластинок слоем толщиной 0,25 мм; если размер пластинок меньше, их берут соответственно больше. В некоторых типах аппаратов для нанесения слоя (аппликаторы) пластинки прижимаются к нижней поверхности направляющих рельсов надутой камерой. Поэтому можно пользоваться пластинками из обычного оконного стекла двойной толщины, так как даже на стеклах разной толщины слой будет одинаковым. Пластинки с нанесенным слоем выдерживают при комнатной температуре 2 ч, после чего активируют 2 ч при 130 °С. Активность сорбента определяется температурой и временем активации— при снижении температуры или уменьшении длительности активации активность понижается. Края пластинки выравнивают шпателем. В связи с тем что влажный воздух комнаты снижает активность сорбента, пластинки либо хранят в эксикаторе, либо перед употреблением прогревают 30 мин при 130°С и сразу же охлаждают.

Специальные добавки к сорбентам (импрегнирование) улучшают разделение смесей углеводов. В ряде случаев целесообразно вместо дистиллированной воды применять растворы ацетата натрия, борной кислоты или двузамещенного фосфата натрия.

Для нанесения образца на пластинку, как правило, используют микропипетки, микрошприцы или капилляры. На пластинки большего размера накладывают шаблон из прозрачной пластмассы с прорезанными отверстиями и 1—3 пятна 1%-ного раствора наносят с интервалом в 1,5 см на расстоянии 1,5 см от нижнего края и 3,0 см от боковых краев пластинки. Для хорошего разделения необходимо, чтобы диаметр пятна был как можно меньше (<3 мм), поэтому используемые растворители должны быть легколетучими.

Смеси, состоящие из двух или трех растворителей различной полярности, часто дают лучшую картину разделения, чем чистые растворители. Выбор проявителя зависит от полярности исследуемых сахаров. Так, для незамещенных углеводов хорошим проявителем является смесь н-бутанол — уксусная кислота — эфир — вода (9:6:3:1 по объему), а для производных углеводов — смеси петролейного эфира (30—60 °С) и ацетона (в различных соотношениях). Чтобы воспроизводимость результатов была достаточно хорошей, рекомендуется брать перегнанные растворители и свежеприготовленные системы проявителей.

Проявление. В хроматографическую камеру наливают соответствующий проявитель слоем толщиной  0,5—1,0 см. Через него пропускают полосу фильтровальной бумаги ватман № 1, которую прикрепляют к боковым стенкам камеры. Камеру герметически закрывают крышкой с зажимами и оставляют на 30 мин для насыщения. Полное насыщение камеры парами проявителя необходимо для получения воспроизводимых результатов. Если в системе содержится легколетучий растворитель, камеру можно поместить в баню со льдом. Когда фронт растворителя на пластинке достигнет высоты 10—15 см, крышку снимают и отмечают положение фронта и лишь после этого вынимают пластинку. В некоторых случаях, чтобы улучшить разделение компонентов, продолжительность проявления увеличивают или проводят двукратное или трехкратное проявление с высушиванием пластинки между ними или двукратное проявление в перпендикулярных направлениях (двумерная хроматография). Длительность проявления определяется характером растворителя: для проявления пластинки размером 20x20 см неполярными растворителями достаточно 20—30 мин, тогда как при проявлении полярными растворителями, содержащими воду, необходимо 1—2 ч.

После высушивания пластинки можно приступать к обнаружению пятен.

Методы обнаружения, не вызывающие деструкции анализируемых веществ.

Если компоненты- смеси окрашены (что, как правило, нехарактерно для углеводов), их легко обнаружить визуально. Некоторые производные сахаров обнаруживают по флуоресценции в ультрафиолетовом свете. Если сами вещества не флуоресцируют, к сорбенту можно добавить флуоресцентный индикатор, например смесь силиката и сульфида цинка, или воспользоваться коммерческим сорбентом, уже содержащим индикатор — смесь марганца и активирован­ного силиката цинка. В этом случае сахара проявляются в УФ-свете в виде темных пятен на светящемся фоне. Иод, родамин В, бромтимоловый синий, 2',7'-дихлорфлуоресцеин, вода — реагенты, позволяющие обнаружить сахара, не разрушая их.

Методы обнаружения, вызывающие деструкцию анализируемых веществ.

Все реагенты, используемые для обнаружения компонентов сахаров на бумажных хроматограммах (кроме реагентов, требующих промывки хроматограмм), пригодны и для тонкослойной хроматографии.

Кроме того, в ТСХ можно использовать и такие реагенты, как концентрированная серная кислота. При прокаливании пластинки, опрысканной кислотой, сахара обугливаются. Как правило, пластинку слабо опрыскивают 5—50%-ным раствором серной кислоты в воде или спирте и нагревают 10 мин при 130°С. При подобной обработке цвет сорбента не изменяется.

Для обнаружения углеводов используются также реагенты, дающие цветные реакции с сахарами и их производными:

1) анисовый альдегид + серная кислота;

2) нафторезорцин +серная кислота

3) нафторезорцин +фосфорная кислота (кетозы дают красное окрашивание, альдозы - синее);

4) азотнокислое серебро + основание;

5) кислый анилинфталат;

6) о-аминодифенил + ортофосфорная кислота;

7) дифениламин + анилин + фосфорная кислота;

8) п-анизидинфталат или хлоргидрат н-анизидина  (гексозы  дают зеленое окрашивание; пентозы — фиолетово-красное; 6-дезоксигексозы — желто-зеленое; уроновые кислоты — коричневое);

9) мочевина + фосфорная или соляная кислота;

10) хлористый 2,3,5-трифенилтетразолий;

11) бихромат калия + серная кислота;

12) азотнокислое железо(III) +солянокислый гидроксиламин;

13) перманганат калия + едкий натр;

14) карбазол + серная кислота;

15) димедон + ортофосфорная  кислота   (кетозы дают серо-зеленое окрашивание);

16) фенол+серная кислота;

17) тимол + серная кислота;

и многие другие.

3.2. КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Тонкослойная хроматография находит все большее применение для количественного определения углеводов. Этот метод чрезвычайно полезен при изучении кинетики реакций, исследовании их механизма и определении выхода продуктов, однако он применим лишь для анализа смесей, компоненты которых можно полностью разделить. Способы количественного определения делят на две большие группы:

а) прямое определение (установление количества вещества непосредственно на пластинке);

б) косвенное определение (элюирование пятен вещества с последующим анализом элюата физическими методами).

Для прямого определения используются денситометрия и радиометрия элюатов. Обе группы методов требуют построения калибровочных кривых, связывающих концентрацию компонента с интенсивностью окраски, степенью поглощения или уровнем радиоактивности соединения.

Если на каждом этапе анализа соблюдаются все меры предосторожности, точность описанных ниже методов составляет 3—5%. Измерение интенсивности окраски сахара или продуктов его распада непосредственно на хроматограмме производится методом денситометрии. Ввиду того, что сами сахара не окрашены, их обрабатывают реактивом, вызывающим появление окрашенного пятна на фоне слоя сорбента. Цвет последнего, как правило, не изменяется (белый). Если сорбент все-таки окрашивается, необходимо, чтобы окрашивание было. Пятна должны иметь четко очерченные границы и не должны выцветать. Даллас, а также Шеллард и Алам подробно рассмотрели факторы, влияющие на точность и воспроизводимость результатов анализа

Чтобы оценить содержание сахаров в образце, можно также сфотографировать хроматограмму (или сделать фотокопию) и, разрезав поученный снимок на полосы, просканировать их на денситометре.

Сахара, несущие радиоактивную метку, количественно определяют непосредственно на хроматограмме с помощью счетчика радиоактивности или радиоавтографическим методом путем денситометрического сканирования рентгеновского снимка хроматограммы.

После вымывания сахара проводят либо прямую оценку его количества, либо предварительно обрабатывают его подходящим реактивом, а затем измеряют поглощение в УФ-  или видимом свете. Трудности возникают в тех случаях, когда с сорбента элюируются посторонние вещества, мешающие измерению поглощения. Чтобы исключить возможные ошибки, необходимо тем же способом иследовать элюат образца сорбента, взятого на уровне пятна.

Сахара, несущие радиоактивную метку, количественно определяют в элюате при помощи жидкостного сцинтилляционного счетчика. Высокая точность оценки достигается даже в тех случая, когда сорбент (~0,1 г) попадает в ампулу счетчика (15 мл).

МЕТОДИКА

ПРЯМОЕ ДЕНСИТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ САХАРОВ (на примере использования кукурузной патоки). Анализ проводится на стеклянных пластинках со слоем силикагеля толщиной 0,5 мм. Пластинки используются сразу после получения. Образцы кукурузной патоки с известным содержанием твердого остатка разбавляют водой до концентрации ~1 % (по этому остатку). С помощью шприца на 25 мкл, снабженного дозатором, полученный раствор наносят на пластинку полосами шириной 6 мм, содержащими от 5 до 90 мкг твердого вещества. Чтобы полосы были узкими, их подсушивают током теплого воздуха. (если образец растворяют в каком-либо органическом растворителе, раствор при подсушивании может «ползти» по внешней стороне иглы шприца, что приводит к потере вещества при нанесении). На каждой пластинке помещается 12 полос: 6 — контрольного сиропа и 6 — анализируемого.

Пластинку проявляют в подходящей системе растворителей при ~25°С; фронт растворителя должен подняться на 12 см от стартовой линии. Мальтоолигосахариды вплоть до декасахарида можно разделить в системе этилацетат—метанол—вода (37:40:23 по объему), однако этот проявитель эффективен лишь для пластинок с силикагелем F-254.

Несколько изменив состав проявителя, его можно применять и с другими сорбентами.

Пластинку высушивают в токе теплого воздуха, опрыскивают 50%-ной серной кислотой и прокаливают при 120 °С для обнаружения пятен. Чтобы полученные результаты были воспроизводимыми, пластинка должна быть равномерно опрыскана мелкими капельками распыляемой жидкости.

Количественную оценку состава смеси проводят методом трансмиссионной денситометрии на денситометре, снабженном самописцем и интегратором для определения площади каждого пика.

Пластинку сканируют в горизонтальном направлении так, что сначала регистрируются все моносахариды, затем дисахариды и т. д. Для определения площадей пиков можно также использовать планиметр. Количество каждого компонента определяют по отношению к соответствующему сахару в стандартном образце путем сравнения площадей пиков. В данном случае необходимость в использовании фильтра к лампе денситометра отсутствует.

При использовании в качестве проявителя смеси (3:4:2 по объему) этилацетат — метанол — вода, которая позволяет получить четкое разделение высших сахаров, рассматриваемый метод обеспечивает высокую точность результатов (табл.4).

Таблица 4. Состав кукурузной патоки

определенный методом бумажной и тонкослойной хроматографии

Страницы: 1, 2, 3, 4